快速鉴定分支杆菌菌种

　　目前，常规的分支杆菌菌种鉴定需采用分支杆菌培养物进行生长特性试验(生长速度、生长温度、光产色实验、多种鉴别培养基上生长试验)及生化特性试验(耐热触酶试验、硝酸盐还原实验、烟酸试验、吐温-80水解试验、尿素酶水解试验、芳香硫酸酯酶试验、铁离子吸收实验、亚硝酸盐还原试验)等10余项试验，综合分析判定结果，方法复杂、费时，慢生长分支杆菌需3~4周方可获得结果，且准确度较差，难以满足临床诊断和治疗的需要。本实验以分支杆菌rpoβ基因为靶基因序列，应用聚合酶链反应-反向斑点杂交法(PCA-RDBHA)快速鉴定分支杆菌临床分离株至种的水平，结果报道如下：

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1分支杆菌分离株 经抗酸染色涂片检测阳性的分支杆菌临床分离株126株，来自我院结核科和解放军第三〇九医院。

　　1.1.2引物及探针 引物Ⅰ和Ⅱ型及21中分支杆菌寡核苷酸探针序列参照文献有伤害生工生物工程有限公司合成。引物Ⅰ和Ⅱ扩增360bpNDA片段。分支杆菌属、结核分支杆菌属复合群、鸟分枝杆菌、胞内分支杆菌、堪萨斯分枝杆菌、脓肿分支杆菌、瘰疬分枝杆菌、胃分支杆菌、偶然分支杆菌、龟分枝杆菌、海分枝杆菌、猿猴分支杆菌、戈登分支杆菌、苏加分支杆菌、马尔摩分支杆菌、蟾蜍分支杆菌、微黄分支杆菌、土地分支杆菌、耻垢分支杆菌、不产色分支杆菌和草分枝杆菌菌种对应的探针分别命名为pMyc、pTub、pAvi、pInt、pKan、pAbs、pScr、pGas、pFor、pChe、pMar、pSim、pGor、pSzu、pMal、pXen、pFla、pTer、pSme、pNon和pPhl。

　　1.2方法

　　1.2.1DNA模板制备 刮取改良罗氏培养基上的分支杆菌临场分离株培养物少许，混悬于1ml无菌TE缓冲液的1.5ml离心管内，10 000r/min离心10min，去上清，沉淀加入DNA提取液50µl，煮沸15min，离心取上清作为NDA模板。

　　1.2.2PCR扩增 在25µl反应体系内，引物Ⅰ，引物Ⅱ终浓度各为0.2µmlo/L，4*dNTP终浓度各为0.2mmol/L，TapDNA聚合酶1U，10*PCR缓冲液2.5µl，DNA模板3µl，加去离子水至25µl。置PCR扩增仪内，扩增条件为94℃变性5min后，94℃ 1min、58℃1min和72℃1min，循环35次，72℃延伸7min，2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

　　1.2.3探针加尾 20µl5*末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)反应缓冲液，探针终浓度为4µmol/L，dTTP终浓度为2mmol/L，TdT80U，加去离子水至100µl，置37℃ 水浴2h，加2µl0.5mol/LEDTA(PH8.0)终止反应。

　　1.2.4反向斑点杂交 ①膜芯片制备：取加尾后探针2pmol按顺序点于尼龙膜上，置60℃干烤固定2h。②杂交：将生物素标记的PCR产物煮沸变性5min，冰浴5~10min。将膜芯片放入反应袋中，加入杂交液(5*SSC，1% blocking试剂，0.1%十二烷基肌氨酸钠，0.02%SDS)5ml，加入变性PCR产物15~20µl，混匀，封袋。54℃孵育30min。③洗膜芯片：洗液Ⅰ(2*SSC，0.1%SDS)室温洗膜2次，每次10min;洗液Ⅱ(0.1*SDS，0.1%SDS)室温洗膜10min1次。④酶结合物与标记PCR产物结合：链亲和素-碱性磷酸酶结合物以适当比例稀释后于杂交后的膜芯片室温作用30min。⑤洗膜芯片：缓冲液(100mmol/LTris-HCL，lmmol/L NaCl，PH7.5)室温洗膜2次，每次10min，缓冲液(100mmol/L Tris-HCL，100mmol/L NaCl，50mmol/L MgCl2，PH9.5)室温洗膜10min1次。⑥显色：用BICP-NBT系统显色，待探针显色后，用TE洗膜终止反应。⑦结果观察：根据杂交斑点判定结果。

　　1.2.5 PCR-DNA测序 对PCR-RDBHA鉴定为NTM的BACTEC-960培养物再次进行PCR扩增，将扩增产物纯化后送上海生工生物工程有限公司进行DNA测序。

　　2结果

　　2.PCR扩增

　　3.引物Ⅰ和引物Ⅱ扩增从126株经抗酸染色阳性的分支杆菌临场分离株培养物制备DNA模板，2% 琼脂糖凝胶电泳检测均可见360bpDNA扩增条带。

　　2.2RDBHA检测

　　PCR阳性扩增产物RDBHA检测结果表明：126株中，115株鉴定为MTC，11株为NIM。NIM中1株堪萨斯分枝杆菌，1株戈登分支杆菌，2株瘰疬分枝杆菌，4株胞内分支杆菌，3株脓肿分支杆菌。

　　2.3PCR-DNA测序

　　11株NTM PCR-DNA测序序列与已知分支杆菌标准菌株rpoβ基因序列进行同源性分析鉴定至种。以测定结果为对照组，PCR-RDBHA与PCR-DNA测序鉴定结果一致。

　　3讨论

　　分支杆菌属包括MTC、麻风分枝杆菌和NTM。目前已报道100余种分支杆菌，其中约30种与人祸不同的动物疾病有关。自20世纪80年代早期以来，结核病及NTM感染疫情在世界范围内呈上升趋势。临床实验室检出NTM的几率正在增加。致病性NTM引起的NTM肺病与肺结核的临床表现、X线特征极其相似，但临床治疗方案不同，许多NTM对抗结核药物天然耐药，常规化疗效果不佳。因此，分支杆菌菌种鉴定对临床诊断、鉴别诊断和治疗均有重要意义。

　　近年来，以PCR为基础的各种分子检测技术的发展，为分支杆菌菌种鉴定提供了新的技术手段。临床上实用而具有开发价值的反向斑点杂交技术，在菌种鉴别检测方面已显示出极大优势。分支杆菌rpoβ基因具有分支杆菌属以及信息保守区和特异性可变区，以此为靶基因建立的PCR-RDBHA所扩增的rpoβ基因360bp片段中含有2个序列高变区，不同分支杆菌菌种间变异较大，利用差异设计的分支杆菌属、MTC和19种NTM菌种寡核苷酸探针排列固定于尼龙膜载体上，与生物素标记的分支杆菌菌种PCR扩增产物进行杂交，再与链亲和素-碱性磷酸酶结合物作用，显色后，根据杂交斑点判定结果，能将分支杆菌鉴定至种的水平。

　　本实验应用PCR-RDBHA检测分支杆菌临床分离株，结果表明，126株培养物中MTC115株(91.3%)，NTM11株(8.7%)，NTM的菌种鉴定及引起的疾病不容忽视。目前，DNA测序是公认的检测分子差异的最可靠方法，对不同分支杆菌菌种间rpoβ基因特异性可变区的差异进行分析，能达到菌种鉴定的目的。本实验以PCR-DNA测序为对照，11株NTM PCR-RDBHA与PCR-DNA测序鉴定结果一致。结果表明，PCR-RDBHA鉴定分支杆菌菌种简便，不需要特殊仪器，易普及，快速，在获得分支杆菌阳性分离株后1d即可获得结果，且结果准确，具有良好的临床应用价值。

（实习编辑：潘信凝）

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